抗生素的使用量创下历史新高，使得抗生素耐药性也在不断增加。快速识别引起感染病原体的先进检测技术能够提高抗生素的治疗效果。目前细菌的检测和鉴定依然依赖于富集的过程，通过细菌培养及核酸扩增以提高靶标分子的浓度，这个过程较复杂且耗时耗力，很难实现真正快速的即时检测。在这篇工作中，作者开发了利用电活性RNA切割DNAzymes（electroactiveRNA-cleavingDNAzymes,e-RCDs）的电分析，鉴定特定的细菌靶标，随后释放一个DNA条形码，将信号转导到电子芯片上。通过对培养液及临床尿液样本的分析，作者发现e-RCDs分析将检测时间缩短至1h内，同时具有较高的灵敏度和特异性。
作者首先制备了四电极的e-DChips，将两个工作电极（捕获和释放通道）及参考和反电极集成到该芯片上，针对小体积样品进行分析。捕获和释放通道是利用电镀法制备的星型金电极结构。星型结构有多个尖锐的边缘，导致扩散受限生长，在边缘形成较厚的高纵横比的沉积层结构。相比于平面的结构，这种结构对于电活性的寡核苷酸的检测限提高约倍。Biotin修饰的e-RCDs与释放通道上的链霉亲和素结合，e-RCDs上的电活性基团（亚甲基蓝）参与电子转移，在方波伏安扫描中产生一个电流峰，说明e-RCDs成功固定在电极表面。在捕获通道中，单链DNA通过巯基与金连接，该单链DNA与释放通道上的电活性序列是互补的（图1）。在细菌样品经过热处理及离心后，活化e-RCD的靶标从菌体内释放出来，加入体系中后，含氧化还原活性基团的DNA条形码序列被切割，随后从释放通道脱离。扩散到捕获通道后，与互补的DNA杂交。最终释放通道的电流峰值降低，捕获通道上的电流峰值提高（图1c）。图1.e-RCDs分析的工程化设计。
在本文中，作者选择截短的及氧化还原修饰的RCDs，这个RCD被E.coil中的蛋白特异地活化，用于鉴定E.coil。作者评估了e-RCD检测临床相关细菌数量的能力，分别测试含有不同浓度E.coil（-CFUmL-1）的buffer和尿液引入芯片前后，即时电流的峰值变化。结果发现释放通道上的信号变化一直小于1倍，但是捕获通道上的信号变化大于50倍。当浓度为CFUmL-1时，从释放通道和捕获通道的变化上，都能有效区分是否含有E.coil（图2）。图2.用方波伏安扫描测试释放通道及捕获通道的电化学响应。在确定了e-RCD的灵敏性之后，作者对特异性也进行了研究。分别以革兰氏阴性菌及阳性菌为例（Bacillussubtilis，Yersiniaruckeri，Clostridiumdifficile,Hafniaalvei和Listeriamonocytogenes），发现在释放通道上无法特异鉴定，而在捕获通道上，含有E.coil组有至少倍（buffer）和倍（尿液）的信号强度变化，明显高于其他组，说明e-RCD具有较高的特异性。继而作者检测了临床上怀疑是尿路感染的病人的尿液样品，发现e-RCD检测的效果具有临床参考价值（图3）。图3.e-RCD分析的临床尿液照片及捕获通道上测定的信号变化。
最后，作者进一步将样品处理、分析及信号读取进行小型化系统的集成，开发了一个简易的、可移动的POC诊断装置（图4）。作者将菌体的裂解和过滤也加入器件中，测试的结果与临床台式机分析结果具有一致性。图4.即时检测未经处理尿液样品中的大肠杆菌。
综上所述，作者设计并开发了一套基于RNA切割的DNAzymes、特异电化学信号读取、纳米电极集成的高特异性、高灵敏度的电化学分析装置，用于快速检测细菌。该装置能有效检测buffer及尿液中低至10CFU的大肠杆菌，具有临床应用价值。文章编号：16文章作者：WY原文链接：