文献推送Small环寡聚糖与异寡 [复制链接]

今天，给大家介绍的是发表在《Small》期刊上的一篇文章《ControllingInteractionsofCyclicOligosaccharideswithHetero-oligomericNanopores:KineticsofBindingandReleaseattheSingle-MoleculeLevel》。

基于工程蛋白纳米孔的单分子电传感技术是近年来发展起来的一种表征大分子的大小、化学组成和结构构象的技术，已被广泛应用于金属离子、有机分子和核酸的检测。虽然通过纳米孔检测单分子是一种强大的技术，但该技术仍存在一定的限制，比如需要有高分辨率来检测分析物的快速移动问题。α-溶血素有限的孔径和长β桶形构象限制了其在核酸或小分子分析中的应用。MspA孔提高了空间分辨率，但核酸的移动速率仍过快。固态纳米孔由于不能以亚纳米的精度组装，因此无法实现生物聚合物的控制传输。然而，蛋白质孔的几何形状是区分不同分析物及其自身类型最敏感的参数。其中，在进行分析物检测时，蛋白质孔与分析物的可控的相互作用是对其进行有效检测的关键。

本文所研究的纳米孔为NfpAB，它与MspA孔相似，是一种可能分别带有NfpA和NfpB中的四个亚基的异寡聚体。NfpAB形状不对称，带有负电荷残基的电荷随机分散在孔的顺式侧，这些带负电荷的残基使孔隙阳离子具有选择性，并可作为阳离子分子的结合位点，如图1所示。该孔的电导直方图显示了孔隙的均匀性和稳定性，并且该孔的单通道电导呈现不对称性。孔隙在电压大于50mV时产生门控，在-mV时保持稳定全开状态。这种不对称的与电压相关的门控机制尚不清楚。此外，在酸性条件下（pH6.0），门控频率大大增加，阻碍了分析物诱导的堵塞检测。

图1

接下来该研究分别从高盐浓度下阳离子环糊精和精胺与NfpAB的相互作用、低盐浓度下阳离子环糊精和精胺与NfpAB的相互作用、基于精胺和环糊精从NfpAB中释放的动力学分子模型三个方面对实验内容进行了详细的说明。

1、高盐浓度下阳离子环糊精和精胺与NfpAB的相互作用

实验过程中在纳米孔更宽的顺式侧加入×10-6Mam6αCD会导致负电压下的离子电流阻塞，而阳离子环糊精（CD）与NfpAB的相互作用正是通过测量结合过程中的离子电流阻塞来说明的。当带正电荷的CD在孔内产生阻塞时，可以通过反转电势从孔的反式侧得到被释放的CD，此外，CD结合过程中的离子电流阻塞变化进一步显示了孔结构的不对称性。

为了阐明分析物的电荷和尺寸对检测的影响，研究者还做了两组分别加入am8γCD和am7βCD的实验。向顺式侧加入am8γCD，当电压为-50mV时，阻塞频率较低，然而当电压为-mV时，CD在不同时间内对孔道的阻塞程度不同，如图2所示，这种现象说明了CD进入孔隙具有电压依赖性。所有的点直方图都显示了五个振幅相同的阻塞步骤，这表明有多个CD与孔结合。根据CD的浓度和施加的电压，这些阻塞的持续时间从几秒钟到几分钟不等。由于高电荷和大尺寸，am8γCD与孔的结合比am6αCD与孔的结合更有效。此外，即使在+25mV和+50mV的极低电压下，am8γCD也能够完全阻塞孔隙，这说明CD被孔收缩反式侧的负电荷残基团电泳捕获。最后，通过改变电压方向和大小，这些被捕获的CD可以从反式侧逐渐释放出来。随着电压从-15mV增加到-30mV，CD释放模式也从高度波动状态变化到完全打开状态。与am6αCD相比，由于am8γCD与孔的结合更紧密，因此需要更高的电压来释放am8γCDs。am7βCD也表现出了与am8γCD类似的附着和释放趋势。实验数据表明，从孔中释放CD所需的跨膜电位的大小是：am8γCDam7βCDam6αCD，这一顺序也正好表明了CD与孔隙的结合强度。

图2

此外，实验研究了阳离子精胺与与NfpAB的相互作用。与CD分子不同的是，精胺与孔隙的结合需要更高的-mV以上的负电位，并且精胺电荷低尺寸小不能使孔隙完全闭合。与CD分子相同的是，精胺也可通过施加反向电压而被释放。

2、低盐浓度下阳离子环糊精和精胺与NfpAB的相互作用

高盐浓度下（1MKCl）的测量结果表明，阳离子CD和精胺与NfpAB的相互作用来源是静电作用。为了进一步研究该静电作用，研究者将盐的浓度降低为×10-3M并研究了电压依赖性的结合和释放动力学。

值得注意的是，在低盐浓度下，即使低浓度的CD（25×10-6M）加入到反式侧后在+10mV的电压下都会导致孔的完全关闭，这说明了分析物与负电荷残基的强分子附着。接着，研究人员逆转电压的极性以此释放被捕获的CD，实验发现，低盐浓度下需要更高的释放电压，这说明低盐浓度下CD与孔的结合能力更强。若将精胺加入到反式侧，直到电压为-60mV，孔隙才完全关闭。-70mV的阈值电压才能使精胺释放（图3），-mV时，我们几乎观察不到精胺的释放，此时的孔已经完全恢复到全开状态。并且精胺的释放时间随着负电压的增加而降低。

图3

3、基于精胺和环糊精从NfpAB中释放的动力学分子模型

根据以上实验结果，研究者提出了一个基于精胺和CD释放动力学的分子模型，解释了阳离子分子的受控运输。从精胺和CD的释放时间，我们可以得知解离常数Koff。现以精胺为例进行说明，在-mV处计算-70mV和-mV之间的解离速率常数为±s-1，如图4。在-mV时，am6αCD从-80mV到-mV的解离常数Koff为±s-1，这一值与精胺的Koff相比较低是因为am6αCD具有更大的体积和更高的电荷密度。同理，在-mV时，am8γCD从-mV到-mV的Koff值比精胺和am6αCD的Koff值都小，为±45s-1。

图4

精胺和CD的解离速率常数与电压图表明所有分析物的Koff随着电压的增加而增加。不管是在高盐浓度下，还是低盐浓度下，分析物与孔的相互作用强度大小总是am8γCD＞am7βCD＞am6αCD＞精胺。

总之，本文报道了一种用于检测单分子环寡聚糖的纳米孔，研究揭示了阳离子分子结合动力学的不对称性，例如CDs与NfpAB的结合说明了其不对称的几何形状和电荷分布。此外，本研究提出了一个模型并提供了分子与NfpAB孔相互作用所需的相关动力学参数的定量描述，这为单分子化学传感奠定了基础。